1.掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。

　　2.學(xué)會使用凱氏定氮儀。

　　二、實驗原理

　　蛋白質(zhì)是由碳、氫、氧、氮及少量硫元素組成。這些元素在蛋白質(zhì)中含量都有一定比例關(guān)系，其中含碳50～55%、氫6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的磷、鐵、鋅、銅和鉬等元素。

　　由于氮元素是蛋白質(zhì)區(qū)別于糖和脂肪的特征，而且絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的氮元素含量相當(dāng)接近，一般恒定在15～17%，平均值為16%左右，因此在蛋白質(zhì)的定量分析中，每測得1克氮就相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)。所以只要測定出生物樣品中的含氮量，再乘以6.25，就可以計算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。

　　生物樣品中的含氮量可用以下反應(yīng)來測定：

　　含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱，被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，氮進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。由大分子分解成小分子的過程通常稱為”消化”。為了加速消化，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高消化液的沸點(290℃→400℃)，加入硫酸銅作為催化劑，過氧化氫作為氧化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。

　　反應(yīng)(1)(2)在凱氏燒瓶內(nèi)完成，反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行，其特點是將蒸汽發(fā)生器、蒸餾器及冷凝器三個部分融為一體。由于蒸汽發(fā)生器體積小，節(jié)省能源，本儀器使用方便，效果良好。硫酸銨與濃堿作用可游離出氨，借水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來H+濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的量計算出待測物中總氮量。

　　三、儀器和試劑

　　儀器：消化管或凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、電爐、消化爐、100mL 錐形瓶、100mL 量筒、表面皿、酸式滴定管、小漏斗、玻璃珠等。

　　試劑

　　1. 血清或卵清蛋白等其他含蛋白質(zhì)樣品

　　2. 消化液：30%過氧化氫、硫酸與水的比例為3∶2∶1，臨用時配制。

　　3. 催化劑：硫酸銅(CuSO4?5H2O)與硫酸鉀(K2SO4)以1：3配比研磨混合。

　　4. 50%氫氧化鈉溶液

　　5. 2%硼酸溶液

　　6. 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(約0.01mol/L)

　　7. 混合指示劑(田氏指示劑)混合指示劑由50mL 0.1%甲烯藍(lán)乙醇溶液與200mL0.1%甲基紅乙醇溶液混合配成貯于棕色瓶中配用。這種指示劑酸性時為紫紅色，堿性時為綠色，變色范圍很窄且很靈敏。

　　四、實驗步驟

　　(一)安裝微量凱氏定氮儀

　　定氮儀由蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)室、冷凝管三部分組成。蒸汽發(fā)生器包括一個電爐及一個3～5升容積的燒瓶。反應(yīng)室上邊有兩個小燒杯，一個供加樣，一個盛放堿液。樣品和堿液由此可直接到反應(yīng)室中。反應(yīng)室中心有一長玻璃管，其上端通到反應(yīng)室外層，下端靠近反應(yīng)室的底部。反應(yīng)室下端底部有一開口，上有橡皮管和管夾。由此放出反應(yīng)廢液。反應(yīng)所產(chǎn)生的氮可通過反應(yīng)室上端細(xì)管經(jīng)冷凝管通入收集瓶中。反應(yīng)室與冷凝管之間由橡皮管相連。

　　安裝儀器時，將蒸汽發(fā)生器垂直地固定在鐵架臺上，用橡皮管把蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)室、冷凝管連接起來。橡皮管連接的部位應(yīng)在同一水平位置。冷凝管下端與實驗臺的距離以放得下收集瓶為準(zhǔn)。安裝完畢后，不得輕易移動，以免儀器損壞。要認(rèn)真檢查整個裝置是否漏氣，以保證所測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　(二)樣品的處理

　　(1)固體樣品 隨機(jī)取一定量研磨細(xì)的樣品放入恒重的稱量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h，用坩堝鉗將稱量瓶取出放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重，隨后繼續(xù)干燥樣品，每干燥1h，稱重一次，恒0重即可。

　　(2)血清樣品 取人血(或豬血)放入離心管中，與冰箱中放置過夜。次日離心除去血凝塊，上層透明清液，即為血清。吸出1mL 血清加到50mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻備用。溶液如果顯混濁，加少量氯化鈉再混勻。

　　(3)卵清蛋白 取2g 卵清蛋白溶于0.9%NaCl 溶液并稀釋至100mL。如有不溶物，離心取上清液備用。

　　(三)消化

　　取5支消化管并編號，在1、2、3號管中各加入精確稱取干燥樣品(注意：加樣品時應(yīng)直接送入管底，避免沾到管口和管頸上)，加催化劑0.5g，混和消化液3mL，在4、5號管中各加相同量的催化劑和混合消化液(若樣品是液體時，還要加與樣品等體積的蒸餾水)作為對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。搖勻后，將5支消化管放在通風(fēng)廚內(nèi)的遠(yuǎn)紅外消煮爐上消化。先用小火加熱煮沸，不久看到消化管內(nèi)物質(zhì)變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，此時要特別注意，不能讓黑色物質(zhì)上升到消化管的頸部，否則將嚴(yán)重地影響樣品測定結(jié)果。當(dāng)混合物停止冒泡，蒸汽與二氧化碳也均勻地放出時，適當(dāng)加強(qiáng)火力。在消化時，應(yīng)是全部樣品都浸泡在消化液中，如在瓶頸上發(fā)現(xiàn)有黑色顆粒，應(yīng)小心地將消化傾斜振搖，用消化液將它沖洗下來。通常消化需要1～3h(對于那些賴氨酸含量較高的樣品需要更長的時間)。待消化液變成褐色后，為了加速消化完成，可將消化管取出，稍冷，加30%過氧化氫溶液1～2滴于管底消化液中，再繼續(xù)加熱0.5h。消化完畢，取出消化管冷卻至室溫。

　　(四)蒸餾

　　(1)儀器的洗滌 儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。目的在于洗去冷凝管中可能殘留的氨。對于處于使用狀態(tài)的儀器(正在測定中的儀器)加樣前使蒸汽通過1～2min 即可，對于較長時間未使用的儀器，必須用水蒸氣洗滌到吸收蒸汽的硼酸—指示劑混合液中指示劑的顏色合格為止。洗滌方法如下：

　　取2～3個100mL 錐形瓶，加入10mL 2%硼酸、2滴混合指示劑，用表面皿覆蓋備用�，F(xiàn)煮沸蒸汽發(fā)生器，其中盛有2/3體積的用幾滴硫酸酸化過的蒸餾水，樣品杯中也加入2/3體積蒸餾水進(jìn)行水封。關(guān)閉夾子使蒸汽通過反應(yīng)室中的插管進(jìn)入反應(yīng)室，再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空燒杯以承受凝集水滴。這樣用蒸汽洗滌5min 左右，在冷凝管下口放一個準(zhǔn)備好的盛有硼酸—指示劑的錐形瓶，位置傾斜，冷凝管下口應(yīng)完全浸泡于液體內(nèi)，繼續(xù)用蒸汽洗滌1～2min，觀察錐形瓶中的溶液是否基本上不變色，若不變色，則證明蒸餾器內(nèi)部已洗滌干凈。下移錐形瓶，使硼酸液面離開冷凝管口約1cm，繼續(xù)通蒸汽1min。最后用蒸餾水沖洗冷凝管外口，排廢開始。用右手輕提樣品杯中棒狀玻塞，

　　使水流入反應(yīng)室的同時，立即用左手關(guān)閉夾子，蓋好玻塞。由于反應(yīng)室外層中蒸汽冷縮、壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液通過反應(yīng)室中插管自動抽到反應(yīng)室外殼中，再在樣品杯中加入2/3體積蒸餾水，如此反復(fù)三次既可排盡廢液及洗滌液。打開夾子將反應(yīng)室外殼中積存的廢液排出，關(guān)閉夾子再使蒸汽通過全套蒸餾儀1~3min，可進(jìn)行下一次蒸餾。

　　(2)樣品及空白的蒸餾 取5個100mL 錐形瓶，分別加入2%硼酸10mL，混合指示劑2滴，溶液呈紫紅色，用表面皿覆蓋備用。

　　把消化管中的消化液全部轉(zhuǎn)移到樣品杯中，用約2mL 蒸餾水沖洗消化管，重復(fù)3次，把洗滌液都倒入樣品杯中，打開樣品杯的棒狀玻塞，將樣品放入反應(yīng)室，用少量蒸餾水沖洗樣品杯后也使之流入反應(yīng)室，蓋上玻塞，并在樣品杯中加約2/3體積的蒸餾水進(jìn)行水封。而后將裝有硼酸—指示劑的錐形瓶放在冷凝管口下方，打開存放堿液杯下端的夾子，放10mL40%氫氧化鈉溶液于反應(yīng)室后，立即上提錐形瓶，使冷凝管下口浸沒在錐形瓶的液面下。反應(yīng)液沸騰后，錐形瓶中的硼酸—指示劑混合液由紫紅色變?yōu)榫G色，自變色時開始計時，蒸餾3～5min。移動錐形瓶，使硼酸液面離開約1cm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口外面，繼續(xù)蒸餾1min，用少量蒸餾水沖洗冷凝管下端尖嘴，將錐形瓶取出，用表面皿覆蓋以待滴定。排液和洗滌等操作與前面相同。排廢洗滌后，可進(jìn)行下一個樣品的蒸餾(每一個樣品要同時做三份，以求得準(zhǔn)確結(jié)果)。待樣品和空白消化液蒸餾完畢后，同時進(jìn)行滴定。

　　(五)滴定

　　全部蒸餾完畢后，用0.001mol/L 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，直至硼酸—指示劑混合液由綠色變回淡葡萄紫色，即為滴定終點，記錄所耗HCl 溶液量。

　　五、計算

　　樣品的總氮含量(%)=(A—B)×0.001×14.008×100/1000×C

　　若測定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)(如血清)，則：

　　樣品中的蛋白質(zhì)含量(%)=(A－B)×0.001×14×6.25×100/1000×C

　　A－滴定樣品用去的鹽酸體積(mL)；

　　B－滴定空白用去的鹽酸體積(mL)；

　　C－稱量樣品的量(g)；

　　0.001－鹽酸的摩爾濃度(mol/L)；

　　14－氮原子量；

　　6.25－系數(shù)(1mL0.001mol/L 鹽酸相當(dāng)于0.14mg 氮)。

　　若樣品中除有蛋白質(zhì)外，尚有其它含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測定要復(fù)雜一些。首先，需向樣品中加入三氯乙酸，使其最終濃度為5%，然后測定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，從而計算出蛋白氮，再進(jìn)一步折算出蛋白質(zhì)含量。

　　蛋白氮=總氮－非蛋白氮

　　粗蛋白質(zhì)含量(%)=蛋白氮×6.25