蛋白質(zhì)是一類最重要的生物大分子，存在于一切生物體內(nèi)，是細(xì)胞的主要成分，是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，是一種純天然的營養(yǎng)物質(zhì)，也是一種天然的表面活性劑。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受二硫鍵的影響很大，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響蛋白質(zhì)的表面活性性能，為了研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性能的關(guān)系，特別是蛋白質(zhì)表面活性性能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，所以測定蛋白質(zhì)二硫鍵含量尤為重要。

　　目前，普遍采用的是Ellman建立的方法，即利用5,5'- 二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）與游離SH 反應(yīng)，在波長412nm 處生成有最大吸收峰的黃色物質(zhì)后，采用分光光度法進(jìn)一步測定吸光度而得。實(shí)驗(yàn)還采用 NTSB 試劑在由亞硫酸鈉存在的條件下與二硫鍵。反應(yīng)是分兩步的，首先是亞硫酸鈉先使二硫鍵裂解，pH 值在 9 以上，反應(yīng)是可逆的雙分子反應(yīng)，這就要求有過量的亞硫酸鈉使二硫鍵迅速裂解。第二步反應(yīng)就是巰基的親核反應(yīng)，即巰基與NTSB 的反應(yīng)，生成一種黃色物質(zhì) NTB 和硫代磺酸鹽。本實(shí)驗(yàn)采用這種方法對豆?jié){蛋白、牛奶蛋白、大豆粉蛋白中的二硫鍵進(jìn)行了測定，都得到了較好的結(jié)果。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料、試劑與儀器

　　大豆粉 安陽漫天雪蛋白有限公司；新鮮豆?jié){ 市售；牛奶 上海光明乳液公司；尿素；EDTA;十二烷基硫酸鈉；三（羥甲基）氨基甲烷；無水亞硫酸鈉；濃鹽酸。以上試劑均為分析純。

　　緩沖液 A:8mol/L 尿素，3mmol/L EDTA,l%SDS 和0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）； 緩沖液B:10mmol/LDTNB,0.2mol/L Tris-HC1（pH8.0）； 緩沖液 C:8mol/L尿素，3mmol/L EDTA,l% SDS,0.1mol/L Na1.2 方法1.2.1 NTSB 的制備100mg的Ellment試劑溶解到10ml 1mol/L的亞硫酸鈉中，在38℃下通入氧氣直到亮紅色溶液變成淡黃色，就表明 NTSB 已經(jīng)生成。

　　1.2.2 豆?jié){中二硫鍵含量的測定方法對豆?jié){進(jìn)行熱處理：在帶塞試管中進(jìn)行熱處理。試管中加入 20ml 豆?jié){，擰緊塞，置于 95℃的水浴中，處理時(shí)間為 90min.處理重復(fù)三次。

　　取樣品4ml（1#）和2ml（2#）各一份，分別加入16ml和18ml 的丙酮，震蕩后靜置10min,再在 3000 ×g 條件下離心 15min,然后再用 10ml 的丙酮懸浮沉淀，再在3000 × g 條件下離心15min,重復(fù)兩次。

　　用緩沖液A 20ml溶解一份處理過的豆?jié){（1#），緩沖液D 20ml 溶解另一份處理過的豆?jié){（2#），震蕩并使其全溶。

　　取1# 溶液 0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5ml 于紙型管中，不同濃度分別測三次后取平均，在紙型管中分別加入0.1ml 的緩沖液B,震蕩30min后加緩沖液A 稀釋至3ml 再測吸光度。以加緩沖液B 而不加樣品為空白。

　　取2# 溶液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5ml 于紙型管中，不同濃度分別測三次，在紙型管中加入相同量的緩沖液 C 振蕩30min 后加緩沖液 D 稀釋至3ml 再測吸光度。以加緩沖液 C 而不加樣品為空白。

　　1.2.3 牛奶中二硫鍵含量的測定方法直接取樣品2ml 兩份，分別加入18ml 的丙酮，振蕩后靜置10min,在 3000 × g 條件下離心 15min,然后再用 10ml 丙酮懸浮沉淀，再在 3000 × g 條件下離心1 5 m i n ,重復(fù)兩次。其他操作同上。

　　1.2.4 大豆粉中二硫鍵含量的測定方法直接用緩沖液 A 20ml溶解0.1000g大豆粉（1#），緩沖液D 20ml溶解0.1000g大豆粉（2#），振蕩并使其全溶。

　　其他操作同上。

　　1.2.5 巰基和二硫鍵含量計(jì)算公式在 pH8 的情況下，NTB 的摩爾消光系數(shù)是 13600/mol/L·cm.

　　SH（μmol/g） = （A412nm×D×10-6）/（C×V×13600）式中，A412nm為吸光度；D 為稀釋倍數(shù)（對游離 SH,D=（3/所取樣品溶液體積）×20;對總巰基D=（3/ 所取樣品體積）× 20）；C 為豆?jié){固形物含量，25mg/ml;V 為所取豆?jié){或牛奶的體積 ml;SS（μmol/g）=總巰基含量

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 豆?jié){中二硫鍵含量的測定丙酮能將蛋白質(zhì)沉淀分離，除去豆?jié){中的脂肪。

　　采用丙酮處理后，破壞了蛋白質(zhì)與脂肪形成的乳化體系，使豆?jié){的混濁度大大下降，采用丙酮處理豆?jié){后既可測定豆?jié){中的游離巰基總量，又可測定蛋白質(zhì)表面的游離巰基和埋藏在分子內(nèi)部的巰基，丙酮處理可使蛋白質(zhì)溶液的混濁度進(jìn)一步降低，從而有利于巰基含量的測定。

　　在測定巰基時(shí)，人們還常常趨向于把蛋白質(zhì)中游離的巰基（未形成二硫鍵的巰基）分為兩部分：一部分是暴露在蛋白質(zhì)表面的巰基，一部分是埋藏在分子內(nèi)部的巰基。一般用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液直接溶解蛋白質(zhì)來測定前者，采用加變性劑如SDS、尿素的緩沖溶液溶解蛋白質(zhì)測定巰基總量。

　　對熱處理90min后的豆?jié){進(jìn)行測定的結(jié)果見圖。

　　2.2 牛奶中二硫鍵含量的測定牛奶也采用丙酮處理，牛奶和豆?jié){一樣，混濁度都比較高，用分光光度計(jì)測定的時(shí)候會影響測定的準(zhǔn)確性，采用丙酮處理后既可以出去牛奶中的脂肪，也可以降低牛奶蛋白質(zhì)溶液的混濁度，有利于蛋白質(zhì)表面的游離巰基和總巰基含量測定的準(zhǔn)確性。由圖5 可以看出，大豆粉中游離巰基的吸光度與所取樣品的體積呈良好的線性關(guān)系，且線性回歸后可得出y=0.3099x+0.0099,R2=0.9966.

　　由圖可知，大豆粉中總巰基含量的吸光度與所取樣品的體積呈正比的，且線性回歸后可得出y=0.5624x-0.0068,R2=0.9988.

　　最后測得大豆粉中二硫鍵的含量為 4.877μmol/g.

　　3 結(jié)論

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分光光度法測定以上三種蛋白質(zhì)中二硫鍵的含量，得到的巰基含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系，說明此方法測定蛋白質(zhì)中二硫鍵的含量可行，且此方法也比較簡單、方便、準(zhǔn)確、快速，可用于食品蛋白質(zhì)中二硫鍵含量的測定，為測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性能的關(guān)系提供了參考。中國糧油儀器在線 http://www.yuanweishulai.cn