淀粉酶作用于淀粉生成葡萄糖。淀粉是生物尤其是人類營(yíng)養(yǎng)所利用的最大量碳源， 而葡萄糖則是生物碳素營(yíng)養(yǎng)與代謝的中心樞紐， 因此奠定了淀粉酶的重要作用。啤酒釀造、黃酒釀造、蒸餾酒生產(chǎn)無一不是利用了淀粉酶的重要性質(zhì)與功能。

　　淀粉酶還可用于酶法生產(chǎn)葡萄糖、麥芽糖、糊精、助消化藥劑和發(fā)酵食品。它還是一些食品和飼料添加劑的主要成分。此外淀粉酶可直接用于絲、棉紡織工業(yè)中的脫漿處理。事實(shí)上，淀粉酶是最早實(shí)現(xiàn)了工業(yè)生產(chǎn)， 目前應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的一個(gè)酶制劑品種， 其產(chǎn)量占整個(gè)酶制劑行業(yè)總產(chǎn)量的50%以上， 其中又以曲霉淀粉酶所占份額最大。

　　據(jù)統(tǒng)計(jì)， 現(xiàn)代酶制劑工業(yè)產(chǎn)品約有三分之二來自曲霉。關(guān)于釀造微生物的育種研究大多是將兩種或更多優(yōu)良工業(yè)性狀綜合到一個(gè)菌株中去。上世紀(jì)八九十年代 日本學(xué)者運(yùn)用種間和屬間原生質(zhì)體融合技術(shù)在曲霉蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶分泌能力的遺傳改良方面作過一些探索。本研究旨在優(yōu)化已篩選的曲霉種間產(chǎn)淀粉酶的條件。

　　1 材料與方法

　　1.1 供試親株

　　試驗(yàn)用 2 個(gè)曲霉出發(fā)菌株，一個(gè)是黑曲霉M70 （Aspergillus niger V. Tiegh M70）， 下文簡(jiǎn)寫為 M70, 為酸性蛋白酶（PEP） 高產(chǎn)菌株； 另一個(gè)是米曲霉 M4 （Aspergillus oryzaeAhlb. M4）， 下文簡(jiǎn)寫為 M4, 為中性蛋白酶（NP）、堿性蛋白酶（ALP） 和淀粉酶（AMY） 高產(chǎn)菌株。兩親株均為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物學(xué)研究室保藏菌種。若干融合子來自前期工作。

　　1.2 主要培養(yǎng)基察氏培養(yǎng)基（MM）， 即基本培養(yǎng)基， 用于菌種鑒定與形態(tài)觀察。

　　淀粉- 麩皮- 硫銨培養(yǎng)基： 麩皮 8 g, 淀粉 2 g,2%硫酸銨溶液 10 mL.淀粉- 麩皮- 豆粕培養(yǎng)基： 麩皮 4 g, 淀粉 2 g,豆粕 4 g, 自來水 10 mL.馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）， 用于菌種保存、活化、繼代。

　　需要說明的是： ①所有上述合成培養(yǎng)基當(dāng)需要采用固體或液體培養(yǎng)時(shí)， 只需加入或不加入 20g/L 瓊脂。②所有合成培養(yǎng)基滅菌條件是 115 ℃、20min;所有天然、半天然培養(yǎng)基滅菌條件是 121℃、

　　1.3 主要測(cè)試指標(biāo)及方法

　　1.3.1 生物量測(cè)定 采用 Nohmi 培養(yǎng)基測(cè)定融合子液培生物量， 重復(fù) 3 次以上。

　　1.3.2 淀粉酶活性測(cè)定 依 DNS 法測(cè)定。定義 1 h 生成 1 mg 葡萄糖當(dāng)量產(chǎn)物所需酶量為 1 個(gè)酶活單位。固體曲浸酶條件同蛋白酶浸提方法。重復(fù)測(cè)定 3 次以上。

　　1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 按 Bradford 法用凱氏定氮儀測(cè)定，重復(fù) 3 次以上。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 氮源對(duì)融合子生物量的影響

　　不同菌株對(duì)同一氮源， 和同一菌株對(duì)不同氮源及不同含氮量的利用能力均不一樣， 甚至同一菌株對(duì)同一氮源的利用情形還因菌齡不同而各異（見表 1）。氮源因子對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的效應(yīng)： 豆粕>魚粉>蛋白胨， 所得平均生物量分別為 4.47、4.44 和1.86 g.無機(jī)氮源明顯差多了， 硝酸鈉略強(qiáng)于硫酸銨，只有 F05 能利用少量硫酸銨， 其余均不能利用。這說明雙親及 F69 均無利用 NH4+- N 的生化能力， 而 F05 有此能力。

　　因此 M70、M04 及 2 株融合子利用有機(jī)氮能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于無機(jī)氮。各菌株利用氮源的能力差異順序： F05>M4>M70>F69, M70 與F69 生物量相近， M4 與 F05 的相近； M4 和 F05利用蛋白胨的能力相近， 比 M70 和 F69 高近40%.F69 利用魚粉能力優(yōu)于 M70, M70 利用豆粕能力高于 F69, 還有 M4 和 F05 利用 NO3- N 能力優(yōu)于 M70 和 F69.在氮源比較單一和貧乏時(shí)， M4和 F05 適應(yīng)能力明顯比 M70 和 F69 強(qiáng)， 但 5 d 與3 d 觀測(cè)結(jié)果不盡相同： ①氮源效應(yīng)從大到小依次為 NaNO3>NH4NO3>（NH4）2SO4）≥脲； ②各菌株生物量大小順序?yàn)?F05>M4>F50>M70>F69, F05超出高親， F69 則低于低親， F50 居于雙親之間；③當(dāng) （NH4）2SO4仍為 2%時(shí)， 如 3d 時(shí)一樣， M70F69、F50 仍表現(xiàn)出 NH4+阻遏效應(yīng)， 不同的是 M4表現(xiàn)部分解銨阻遏效應(yīng)， 生物量為 1.098g（FW）。

　　可見隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 銨對(duì) M4 的阻遏可以被部分解除； ④將硫酸銨培養(yǎng)基中氮源含率由 2%降至 0.2%時(shí)， 所有 NH4+阻遏效應(yīng)均被部分或全部解除。可見 NH4+阻遏效應(yīng)的表現(xiàn)是以較高 NH4+濃度為前提的； ⑤在淀粉培養(yǎng)基與 4 種氮源配合中，脲效應(yīng)與（NH4）2SO4幾乎完全相同， 即 M70、F69、F50 均表現(xiàn)明顯脲阻遏效應(yīng)， 唯獨(dú) F05 和 M4 能利用脲生長(zhǎng)， 表現(xiàn)出解脲阻遏性狀。⑥所有菌株都能利用 2%NaNO3, 與 3 d 時(shí)的結(jié)果相同。

　　2.2 氮源對(duì)親株及融合子淀粉酶分泌量的影響

　　分析表可得出如下結(jié)論：

　�、儆袡C(jī)氮源更有利于產(chǎn)淀粉酶。在 3 d 時(shí)， 產(chǎn)淀粉酶的氮源順序?yàn)槎蛊?gt;魚粉>蛋白胨； 5 d 時(shí)變化為豆粕>蛋白胨>魚粉。②產(chǎn)淀粉酶菌株差異表現(xiàn)穩(wěn)定， 不因菌齡和氮源不同而變化， 其順序均為 M70>M4>F05>F69, 極差達(dá) 4.87 倍（5 d） 至 7.37 倍（3 d）。

　　具體分析發(fā)現(xiàn)（ 以 5d 為依據(jù)）： ①以蛋白胨作為氮源時(shí)， 只有M70 和 F05 有酶活， 分別為 525 U/mL 和 98 U/mL, 前者比后者高 4.4 倍； ②當(dāng)?shù)�源是豆粕時(shí)，M70 和 F69 酶活分別為 1 329 U/mL 和 325 U/mL,懸殊 3.1 倍， 而 M4 和 F05 酶活分別為 251 U/mL和 160 U/mL, 懸殊達(dá) 56%; ③當(dāng)以魚粉為氮源時(shí)，M70 和 F69 均比豆粕作氮源時(shí)低一些， 分別為921 U/mL 和 148 U/mL.而 M4 和 F05 酶活明顯比豆粕作氮源時(shí)高， 分別達(dá) 379 U/mL 和 266 U/mL.可見豆粕宜于 M70 和 F69, 魚粉宜于 M4 和 F05產(chǎn)淀粉酶。