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常見5種蛋白質(zhì)中氨基酸的分析實驗

來源: http://www.yuanweishulai.cn  類別:實用技術(shù)  更新時間:2015-03-25  閱讀

  在生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究中,分離、提純蛋白質(zhì)是重要而繁鎖的工作。生物體中各種蛋白質(zhì)的氨基酸組成(或構(gòu)筑)不盡相同。鑒定純蛋白的最基本方法之一是測定其氨基酸的組分及含量。幾年來,我們對一些蛋白質(zhì)樣品(達電泳純)進行氨基酸分析,為鑒定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與純度提供了一項指標。有些蛋白質(zhì)是國內(nèi)首次提取或報道,F(xiàn)將其中幾種介紹如下。

  材料與方法

  一、蛋白質(zhì)樣品 S一10.蛋白、GFAP由本室提得,SOD由生化教研室提得,膠原111由附一院傳染病研究室提得,鐵蛋自由血液研究室提得。

  二、水解方法 蛋白樣品約Zmg,5.7mol/L鹽酸2ml中加入琉基乙酸和10帕苯酚各10川,抽真空10min,封管,110℃水解20h,處理后分板

  三、分析方法 使用日立835氨基酸分析儀 KDN系列定氮儀 配置紫金n微機,標準蛋白水解物分析程序,定性定量17種蛋白組分氨基酸。膠原使用生理體液分析系統(tǒng)測定。

  四、作圖 使用紫金11微機,自編程序,標準圖譜從中心點出發(fā),長度代表氨基酸mol帕。圖上半部為極性氨基酸(右上半酸性,左上半為堿性);圖下半部分為疏水性氨基酸。色氨酸、朧氨酸另計。

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  鑒定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與純度,需要分析氨基酸的組成及含量。氨基酸分析定量準確程度與蛋白質(zhì)的水解條件至關(guān)重要。我們在雙蒸水與優(yōu)級純鹽酸共沸而蒸得的5.7mol/L鹽酸水解浪中加入適量苯酚和琉基乙酸,能有效防止酪氨酸、甲硫氨酸等易氧化組分的破壞[l'.氨基酸分析也是探討蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的途徑之一。本文所提蛋白質(zhì)中,S一100蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白提自牛腦組織,超氧化物歧化酶提自豬血,膠原提自牛軟骨,鐵蛋白分別提自人和馬的脾臟組織。這些關(guān)系各器官功能的活性蛋白質(zhì),氨基酸組成各有其特點。將分析數(shù)據(jù)輸入電腦,用自編程序,可以按標準模式繪制出各蛋白質(zhì)的氨基酸組成的特征圖像,便于鑒別。

  1、S一100蛋白(MWx6000)為腦組織中的一種高度酸性蛋白質(zhì),曾被認為是膠質(zhì)細胞的一種標記蛋白,后在其他組織也有少量發(fā)現(xiàn),有人推測其與記憶有關(guān)。s一100蛋白可用于神經(jīng)元細胞和膠質(zhì)細胞實驗分離的鑒測,腦腫瘤病理學(xué)鑒別診斷,以及神經(jīng)腫瘤細胞體外培養(yǎng)系的鑒定等。其氨基酸組成的特點是富含酸性分子而不含脯氨酸。氨基酸特征圖中,如果我們可以把整個分子看作一片樹葉狀的話,各組分則成為樹葉的葉脈,各組分間的連線看作樹葉葉緣,緣各組分中幾個主要氨基酸構(gòu)成1片葉子中的幾個葉瓣。S-100圖右上角含量最高的谷氨酸成為突出的一葉尖,由于不含脯氨酸,整片葉子就有開裂之感。甘氨酸、丙氨酸、擷氨酸含量接近,形成右下部扇形一葉瓣,門冬、谷、亮,賴等氨基酸形成的葉瓣窄而長,由于相鄰組分含量低,各葉瓣的叉口幾乎至圓心。

  2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(簡稱GFAP,MW54000)是神經(jīng)組織星形細胞中絲纖維的主要成分,也是星形細胞的標記蛋白。免疫組化分析顯示僅星形細胞、星形細胞瘤、室管膜瘤呈陽性反應(yīng),與外周神經(jīng)及器官和其他組織不反應(yīng)。由于特異性強,分離GFAP,并用其制備抗體作免疫組化分析,可鑒別診斷顱內(nèi)腫瘤。GFAP含通常的17種組分,以酸性氨基酸為主,谷氨酸、門冬氨酸含量最豐,甲硫氨酸含量甚微。GFAP特征圖中,可視谷氨酸為中間,門冬氨酸、丙氨酸在兩側(cè)的三瓣葉,而含量較高的亮氨酸似為一葉柄,門冬氨酸、丙氨酸含量接近,形成對稱性兩葉瓣。

  3、超氧化物歧化酸(簡稱sOD,MW34000)是各種生物體中的一種主要抗氧化酶。本院生化教研室提取的Zn一CuSOD含較多甘氨酸,幾乎不含甲硫氨酸。特征圖形似兩片樹葉重合,門冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸組成1片葉子的三瓣,而谷氨酸、甘氨酸、領(lǐng)氨酸為另一葉三瓣,因分子幾乎不含甲硫氨酸,在顴氨酸和異亮氨酸間形成缺口,似兩片葉子的結(jié)合部。

  4、膠原(MW3o000)是膠原纖維的主要蛋白質(zhì)。提純膠原有助于肝臟纖維化的研究。傳染科提純的膠原為IH型。其氨基組成有2個特征,一是含有其他機體蛋白很少有的經(jīng)脯氨酸(約10腸)和經(jīng)賴氦酸(約2腸)。一般講,脯氨酸和經(jīng)脯氨酸含量越高,蛋白分子對熱或化學(xué)變性作用的抵抗力越強。二是甘氨酸含量幾乎占總量的1/3.由此推測膠原分子中每隔2個其它氨基酸殘基即連接l個甘氨酸殘基。膠原的這種特有的氨基酸結(jié)構(gòu)與排列,使其與一般蛋白質(zhì)不同,具有很強的韌性與拉力,以保證結(jié)締組織的功能。膠原的形狀特征與眾不同,由于以甘氨酸為主,其余組分較少,故似一披針形的單瓣葉,其極性度也大大低于其他蛋白。

  5、鐵蛋白(MW45000)是由24個亞基組成、含鐵約20腸的大分子蛋白質(zhì)。我院血液室為研究血液病提純的人脾鐵蛋白與馬脾鐵蛋白,在氨基酸組成上不盡相同。但都含有通常的17種氨基酸組分,各組分含量相對較均勻,因而其構(gòu)筑圖形上沒有大的缺口。