蛋白質(zhì)測(cè)定儀以及幾種常用方法介紹
來源： http://yuanweishulai.cn/ 類別：實(shí)用技術(shù) 更新時(shí)間：2021-01-19 閱讀次
蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，對(duì)人的身體健康有著直接的影響，因此，蛋白質(zhì)含量檢測(cè)是食品、飼料等諸多行業(yè)日常檢測(cè)項(xiàng)目中必須檢測(cè)的重要一項(xiàng)，為此，本文簡(jiǎn)單推薦蛋白質(zhì)測(cè)定儀以及幾種蛋白質(zhì)測(cè)定方法。
1、蛋白質(zhì)測(cè)定儀所應(yīng)用的是經(jīng)典的凱氏定氮法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，其原理將有機(jī)化合物與硫酸共熱使其中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨，在這一步中，經(jīng)常會(huì)向混合物中加入硫酸鉀來提高中間產(chǎn)物的沸點(diǎn)。樣本的分析過程的終點(diǎn)很好判斷，因?yàn)�，這時(shí)混合物會(huì)變得無色且透明。在得到的溶液中加入少量的氫氧化鈉溶劑，然后蒸餾，這一步會(huì)將銨鹽轉(zhuǎn)化成氨，而總氨量會(huì)由反滴定法確定：冷凝管的末端會(huì)浸在硼酸溶液中。氨會(huì)和酸反應(yīng)，而過量的酸則會(huì)在甲基橙的指示下用碳酸鈉。滴定所得的結(jié)果乘以蛋白質(zhì)系數(shù)就可得到蛋白質(zhì)含量了。
2、紫外分光光度法
蛋白質(zhì)分子中存在含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，使蛋白質(zhì)對(duì)280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的吸光值與其濃度成正比，可作定量測(cè)定。該法操作簡(jiǎn)單、快捷，并且測(cè)定的樣品可以回收，低濃度鹽類不干擾測(cè)定結(jié)果，故在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛被采用。但此方法存在以下缺點(diǎn)：
1.當(dāng)待測(cè)的蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基含量差別較大會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，故該法適用于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的樣品。
2.若樣品中含有其他在280nm吸收的物質(zhì)如核酸等化合物，就會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分別測(cè)定280nm和260nm兩處的光吸收值，通過計(jì)算可以適當(dāng)?shù)南怂釋?duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾作用。但因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不同的，雖經(jīng)校正，測(cè)定結(jié)果還存在著一定的誤差。
3、Bradford法
1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，是一種能夠迅速并且準(zhǔn)確的定量蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收光的改變，從465nm變?yōu)?95nm。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度(最低檢出量為1μg)。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程，大約只需2min，結(jié)合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子(如K+，Na+，Mg2+、)、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，而大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定，少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。由于染色法簡(jiǎn)單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。
4、雙縮脲法
具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中能與Cu2+絡(luò)合呈紫紅色，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用比色法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算可以確定蛋白質(zhì)濃度。
5、Folin-酚試劑法
測(cè)定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，它是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。它操作簡(jiǎn)單、迅速、靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成，試劑A相當(dāng)于雙縮脲試劑。蛋白質(zhì)中的肽鍵與試劑A中的堿性硫酸銅反應(yīng)形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物可與試劑B中磷鉬酸-磷鎢酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)。由于磷鉬酸與磷鎢酸易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)。而蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸均可發(fā)生此呈色反應(yīng)。顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
此法易受蛋白質(zhì)樣品中酚類化合物及檸檬酸的干擾。另外，試劑B中的磷鉬酸-磷鎢酸僅在酸性pH值時(shí)穩(wěn)定，故在將試劑B加入到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液時(shí)，必須立即混合均勻。以確保還原反應(yīng)能正常發(fā)生。此法也適用與酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。
1、蛋白質(zhì)測(cè)定儀所應(yīng)用的是經(jīng)典的凱氏定氮法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，其原理將有機(jī)化合物與硫酸共熱使其中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨，在這一步中，經(jīng)常會(huì)向混合物中加入硫酸鉀來提高中間產(chǎn)物的沸點(diǎn)。樣本的分析過程的終點(diǎn)很好判斷，因?yàn)�，這時(shí)混合物會(huì)變得無色且透明。在得到的溶液中加入少量的氫氧化鈉溶劑，然后蒸餾，這一步會(huì)將銨鹽轉(zhuǎn)化成氨，而總氨量會(huì)由反滴定法確定：冷凝管的末端會(huì)浸在硼酸溶液中。氨會(huì)和酸反應(yīng)，而過量的酸則會(huì)在甲基橙的指示下用碳酸鈉。滴定所得的結(jié)果乘以蛋白質(zhì)系數(shù)就可得到蛋白質(zhì)含量了。
2、紫外分光光度法
蛋白質(zhì)分子中存在含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，使蛋白質(zhì)對(duì)280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的吸光值與其濃度成正比，可作定量測(cè)定。該法操作簡(jiǎn)單、快捷，并且測(cè)定的樣品可以回收，低濃度鹽類不干擾測(cè)定結(jié)果，故在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛被采用。但此方法存在以下缺點(diǎn)：
1.當(dāng)待測(cè)的蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基含量差別較大會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，故該法適用于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的樣品。
2.若樣品中含有其他在280nm吸收的物質(zhì)如核酸等化合物，就會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分別測(cè)定280nm和260nm兩處的光吸收值，通過計(jì)算可以適當(dāng)?shù)南怂釋?duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾作用。但因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不同的，雖經(jīng)校正，測(cè)定結(jié)果還存在著一定的誤差。
3、Bradford法
1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，是一種能夠迅速并且準(zhǔn)確的定量蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收光的改變，從465nm變?yōu)?95nm。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度(最低檢出量為1μg)。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程，大約只需2min，結(jié)合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子(如K+，Na+，Mg2+、)、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，而大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定，少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。由于染色法簡(jiǎn)單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。
4、雙縮脲法
具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中能與Cu2+絡(luò)合呈紫紅色，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用比色法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算可以確定蛋白質(zhì)濃度。
5、Folin-酚試劑法
測(cè)定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，它是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。它操作簡(jiǎn)單、迅速、靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成，試劑A相當(dāng)于雙縮脲試劑。蛋白質(zhì)中的肽鍵與試劑A中的堿性硫酸銅反應(yīng)形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物可與試劑B中磷鉬酸-磷鎢酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)。由于磷鉬酸與磷鎢酸易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)。而蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸均可發(fā)生此呈色反應(yīng)。顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
此法易受蛋白質(zhì)樣品中酚類化合物及檸檬酸的干擾。另外，試劑B中的磷鉬酸-磷鎢酸僅在酸性pH值時(shí)穩(wěn)定，故在將試劑B加入到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液時(shí)，必須立即混合均勻。以確保還原反應(yīng)能正常發(fā)生。此法也適用與酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。
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